ASO 기반 신경정신질환 치료제 개발

□ ASO 개발역사


◾ 기반기술의 발전


1960년대 초에 위스콘신대 Har Gobind Khorana 교수가 핵산분자를 합성하였다. Khorana 교수는 세포핵의 유전물질이 단백질 합성을 조절하는 방법을 알아내는 데 도움이 된 연구로 1968년 Robert Holley, Marshall Nirenberg와 함께 노벨상을 공동 수상했고, 1970년 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 합성하였으며, 그 과정이 널리 알려졌다. 뉴클레오타이드는 모든 살아있는 유기체와 식물에서 DNA와 RNA의 기본 구성 요소이다. 올리고뉴클레오타이드는 수 개에서 수십개의 뉴클레오타이드 단위체가 합성된 중합체를 말한다. 보통 15~25염기의 핵산을 이르며 합성된 올리고뉴클레오타이드는 대부분 단일가닥이다. Khorana 교수의 연구를 기반으로 올리고뉴클레오타이드의 인공적인 합성법이 널리 알려져 원하는 서열의 올리고뉴클레오타이드를 주문할 수 있도록 자동화되고 상업화되었다.


ASO 아이디어 발표


1978년 하바드 의대 Paul Zamecnik 교수는 합성 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotides)로 관심있는 단백질을 암호화하는 mRNA에 혼성화하여 그 표적 단백질의 발현을 억제하는 아이디어를 발표하였다. 합성 DNA 올리고머는 그 서열이 센스서열이라고 하는 표적 유전자의 mRNA에 상보적이기 때문에 올리고헥산 안티센스(antisense oligonucleotides, ASO)로 불리게 되었다. 안티센스는 RNA 혹은 상보적 DNA에서 유래하는 유전인자를 가리킬 때 사용되는 용어이다. 올리고뉴클레오티드는 전통적인 작은 분자 약물에 비해서 상대적으로 큰 분자이다. 하지만 단클론 항체(monoclonal antibody)와 같은 대부분의 단백질 분자보다는 크기가 작다. 자연적으로 발생하는 외래 뉴클레오티드 서열이 도입되면 일반적으로 체액에 있는 풍부한 뉴클레아제 효소에 의해 분해된다.


1세대 ASO


약물로서의 ASO의 잠재력은 명백했지만, ASO 기반 약물의 실제 개발은 장애물에 직면했다. 첫째, 핵산은 내인성 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉽다. 네이티브 형태의 ASO는 신장을 통해 걸러지기 전에도 반감기가 매우 짧니다. 둘째, 합성 ASO는 크고(약 30kD) 음전하를 띤 분자이므로 세포내 DNA 또는 mRNA 표적에 도달하기 위해 혈관내피, 조밀한 세포외 기질, 세포 및 핵막을 가로지르지 않는다. 셋째, ASO의 비표적 효과(off-target effect)는 치명적인 부작용으로 이어질 수 있다. 넷째 합성 ASO는 면역 원성(immunogenic)이 될 수 있다. 1980년대에 1세대 ASO를 화학적으로 변형한 근거는 뉴클레아제 분해를 줄이는 것이었다. 이는 뉴클레오티드의 포스페이트 그룹에서 비가교 산소원자 중 하나를 황그룹(포스포로 티오에이트[phosphorothioates]), 메틸그룹(메틸 포스포네이트[methyl phosphonates]) 또는 아민(포스포로아미데이트[phosphoroamidates])으로 대체하여 달성되었다. 포스포로티오에이트 치환(Phosphorothioate substitution, PS)은 뉴클레아제 분해에 저항성을 갖는 뉴클레오타이드 간 연결을 만드는 가장 초기이자 가장 일반적으로 사용되는 변형이다. 이러한 변형은 불행히도 동물모델에서 강한 혈소판 활성화, 응집 및 혈전 형성을 유도하는 것으로 나타났으며, 인간 혈소판을 사용한 시험관 내 실험에서 인간의 안전성에 대한 의문을 제기했다. 거대세포바이러스 망막염(cytomegalovirus retinitis, CMV) 치료제로 1998년 미국 FDA 승인을 받은 포미비르센은 1세대 ASO이다.


2세대 ASO


제1세대 ASO의 부작용을 극복하고자 제2세대 ASOS이 개발되었다. 2세대 ASO에서 사용되는 변형은 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 변형이다. 이 변형은 안티센스 계열에서 가장 널리 사용되는 화학적 변형으로, 인산기의 중합하지 않은 산소원자 하나가 황으로 대체된다. 이 작은 화학적 변화는 약리학적 특성에 큰 영향을 미친다. 분해효소에 대한 안정성이 증가되고, 높은 비율로 혈장단백질과 결합한다. 반대로 비특이적 단백질 친화도의 증가로 비표적효과(off-target effect)가 나타날 수 있다. 비표적효과란 목표했던 유전자와 다른 표적에 영향을 미쳐 나타나는 부작용을 의미한다. 미포메르센을 포함하여 다른 안티센스 치료제에서도 이러한 비표적효과는 실제로 상당한 부작용으로 나타남이 확인되었다. 특히 포스포로티오에이트는 주사부위, 간과 같이 약물의 농도가 높은 곳에서 독성을 유발한다. 안티센스 계열의 약물에서 논란이 되는 여러 문제들이 포스포로티오에이트 변형에서 유발되는 것으로 지금은 잘 알려져 있지만, 적절한 대체방법이 아직 없다. 뉴클레오티드의 리보오스(ribose)에 변형을 가하는 것(2’-methyl, methoxyethyl, other alkyl chain, locked nucleic acid [LNA])은 분해효소에 대한 안정성을 증가시키는데, 단백질 결합과 세포 내 흡수에 필요한 부분적인 포스포로티오에이트 변형과 함께 할 때에 효과적일 수 있다. 현재 임상평가 중인 차세대 안티센스 화합물은 비슷한 독성이 나타날 것으로 생각되지만, 높은 안정성 확보로 투여량이 감소하게 되어 독성이 낮게 나타날 것으로 예상된다.2세대 안티센스 치료제로써의 아이오니스의 미포메르센(mipomersen)은 포스포로티오에이트 변형을 갖고 있다.미포메르센은 가족성 고콜레스테롤혈증(familiar hypercholesterolemia)의 치료용으로 2013년에 FDA 승인을 받았다. 미포메르센은 아포지질단백질 B100의 발현을 억제하여 혈중 콜레스테롤, LDL-C, 아포지단백질 B100의 레벨을 낮춘다. 미포메르센은 최초로 전신적으로 적용된 올리고뉴클레오티드로 대표되기도 한다. 미포메르센은 주로 간세포에서 작용하는데, 그 화학적 변형으로 인해 간 조직 내의 높은 축적이 가능하다. 혈장단백질과 강하게 결합함으로써 신장으로의 배출(신 배설, renal elimination)이 방지된다. 미포메르센이 ALT(liver alanine transaminase), AST(liver aspartate transaminase), 지방간증 (hepatosteatosis)을 증가시키는 것 같은 경향이 나타나 승인절차 도중 논란이 일었다. 결과적으로 미포메르센은 미국에서는, 특별한 제한 하에 심각한 가족성 고콜레스테롤혈증에 대한 치료제로 승인되었다. 유럽에서는, 장기간 사용에 대한 독성에 대한 우려로 EMEA 승인을 받지 못했다.


3세대 ASO


3세대 ASO는 대상 사이트로의 전달을 향상시키기 위해 개발되었다. 이 기술에서 올리고 부하는 지질입자, 리포좀, 나노 입자와 같은 담체 또는 리간드에 공유 결합되며, 최근에는 당 N-아세틸 갈락토사민(sugar N-acetyl galactosamine)이 표적 부위로의 안전한 전달을 향상시킨다. DMD 치료용으로 승인된 에테플리센은 3세대 포스포로디아미데이트 모르폴리노(phosphorodiamidate morpholino) ASO이다.


AntagoNAT


2006년에 스크립스 연구소 Claes Wahlested 교수는 전체 전사체(transcriptome)의 시퀀싱은 모든 종류의 비암호화(noncoding) RNA가 수천개의 NAT(natural antisense transcripts)를 포함한 정크 DNA로부터 파생된다는 것을 밝혔다. 안티센스 전사는 포유류 게놈에 널리 퍼져있는 현상으로, NAT라고 하는 RNA 분자를 생성한다. NAT는 다양한 전사 및 전사 후 조절 메커니즘을 적용하여 살아있는 세포의 정상적인 기능에 중요한 다양한 생물학적 역할을 수행하지만 그 기능 장애는 인간의 질병과 관련될 수 있다. Claes Wahlested 교수는 NAT RNA는 동족 센스 RNA의 발현을 차단할 수 있어, NAT가 유전자 발현에 영향을 주는 치료 타겟이 될 수 있다고 제안하였고, 80개의 특허를 출원한 후 Joe Collard의 자금 지원을 받아 2010년에 cuRNA를 설립하였다. 안티센스 전사체는 단백질을 생성하지 않으므로, 소분자 약물을 사용하는 대부분의 고전적 접근법은 효과가 없다. 따라서 이러한 RNA 분자에 영향을 미치기 위해 올리고 뉴클레오티드 기반 전략이 개발되었다. 2012년 Claes Wahlested 교수팀은 NAT가 특정 유전자를 억제할 수 있고, NAT 억제로 특정 유전자 발현이 상향조정될 수 있음을 보였다. cuRNA는 2011년 글로벌 헬스케어 기업인 옥코 헬스(OPKO Health)에 인수되어 유아의 중증 간질인 드라벳 중후군(Dravet syndrome)과 출산후 신경장애인 렛트 증후군(Rett syndrome) 등의 치료제를 AntagoNAT(Natural Antisense Transcripts Antagonist) 기술을 사용하여 개발중이다.


□ ASO 기반 신경정신질환 치료제 개발


ASO 접근법은 작용/길항 효과의 복잡한 혼합을 생성할 수 있는 수용체 상호작용에 의존하지 않는 이점이 있다. ASO는 주어진 mRNA를 정확하게 표적화하기 위해 빠르고 간단한 프로세스로 설계 및 합성될 수 있으며, 단일 단백질 패밀리의 다른 구성원과 동일한 mRNA의 다른 이소폼을 쉽게 구별할 수 있다. RNAi에 비해 ASO의 몇 가지 장점이 있다. RNAi와 달리 ASO는 뉴런에 의해 쉽게 흡수되며 용량의존적이고 가역적인 효과가 있다. ASO는 또한 siRNA 기반 접근법에서 잠재적인 독성원인인 내인성 microRNA 경로를 포화시키지 않는다는 장점이 있다. ASO는 일반적으로 매우 선택적이며 성숙한 mRNA가 아닌 pre-mRNA에 결합하여 게놈의 다른 곳에서는 나타나지 않는 ASO에 대한 특정표적서열을 선택할 수 있기 때문에 인트론과 엑손을 모두 표적화할 수 있다. 그러나 바이러스 매개 siRNA 접근법과 달리 치료효과를 유지하려면 ASO를 반복적으로 투여해야 한다. 표적 RNA(또는 아마도 표적외 RNA)의 억제로 인해 원치 않는 결과가 발생하는 경우, ASO는 중단이 가능하다는 이점이 될 수 있다. ASO는 많은 가능성을 가지고 있지만 생체내 세포전달 문제가 안티센스 치료제 개발에 가장 큰 문제로 제기되고 있다. 이로 인하여 직접 주사가 가능한 망막 질환분야에서 치료제 개발이 먼저 시도되었고, 간질환 등으로 확대되고 있다.


치료용 ASO 기전


치료용 ASO는 스플라이싱(엑손 스키핑 또는 엑손 포함)을 변경하거나, 리보핵산가수분해효소 H(Ribonuclease H, RNase H)를 동원하여 표적 분해를 유도하거나, 번역을 방해함으로써 표적서열 및 ASO 화학에 따른 작용 방식으로 표적 mRNA의 발현을 수정한다. 스플라이싱(splicing)교정 올리고뉴클레오티드는 유전자 돌연변이 또는 잘못된 유전자 스플라이싱으로 인한 희귀질환에 고무적인 효과를 나타냈다. 내인성 RNase H 효소 RNASEH1은 DNA 기반 올리고 뉴클레오티드가 동족 mRNA 전사체에 결합할 때 형성되는 RNA-DNA heteroduplex 기질을 인식하고 RNA 19 분해를 촉매한다. ASO 결합 부위의 절단은 표적 RNA를 파괴하여 표적 유전자 발현을 억제한다. 이 방법은 질병 유전자를 하향 조절하는 수단으로 이용되고 있다. RNase H 활성을 지원하는 ASO는 메커니즘이 현저하게 다르지만 작용모드에서 siRNA와 다소 유사하다. siRNA에 의해 생성된 RNAi은 RNase H를 지원하는 ASO에 의해 활성화되는 것과는 독특하게 다른 경로인 표적 mRNA 절단으로 이어지는 RNA 유도 침묵 복합체 어셈블리(RNA‐induced silencing complex assembly)를 포함한다. 압타머(aptamer)는 항체의약품과 유사하게 3차원적인 구조가 특정 타겟 단백질에 결합할 수 있도록 설계되어, 그 단백질이 기능을 못하게 한다. 핵산은 3차원 2차 구조의 형성을 통해 단백질과 상호작용할 수 있다. 치료제로 이용되는 핵산 앱타머는 특정 단백질에 대한 길항제 또는 작용제역할을 할 수 있는 리간드이다. 다른 종류의 핵산 치료제와 달리 압타머는 합리적으로 설계되지 않았다. 대신 지수적 농축에 의한 리간드의 체계적 진화(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)라고 하는 시험관내 진화 방법론에 의해 생성된다. 전달문제는 수용체 등을 표적으로 하는 것으로 해결하였으며, 분해문제는 화학적 변형으로 해결한다. SELEX후 화학적 변형의 도입은 압타머 약물 유사 특성을 더욱 향상시키는 대안적인 접근 방식이다.