차등초원심분리 기반 엑소좀 분리

세포배양배지에는 엑소좀 외에도 여러 유형의 막성소포가 포함되어 있다. 차등 초원심분리(Differential ultracentrifugation, UC)는 엑소좀 격리를 위한 고전적인 프로토콜이다[1]. 차등원심분리중 특정 g-force/k 계수 사용은 엑소좀의 순도와 수율에 큰 영향을 미칩다[2]. 이 분야에서의 지식격차를 해소하기 위하여 2012년 뉴욕에서 개최된 ISEV (International Society for Extracellular Vesicles)에서 표준화가 논의되었다.

저속원심분리(300g, 2000g, 10,000g)로 세포와 파편을 제거한 후, 초원심분리(100,000g)를 70분 이상 실시한다[4]. 다음에 무혈청성장배지로 세척하여 유리잔류단백질(free residual proteins)을 제거한다.

초원심분리과정은 시간이 많이 걸리며 여러 번의 수작업으로 노동 집약적인 단계를 거치며 값비싼 장비가 필요하다. 분리 효율은 시료마다, 작업자마다 다르며 로터 유형, 가속도 및 시료 점도에 따라 다르니다. 더욱이, 반복된 원심 분리 단계는 엑소좀 구조를 손상시키고 품질을 저하시킬 수 있다. 또한 샘플의 가용성 단백질은 엑소좀과 함께 응집되어 오염을 유발하고 순도에 악영향을 미칠 수 있다.

엑소좀에서 큰 백질 응집체를 분리하는 한가지 방법은 서로 다른 부유 밀도를 이용하여 선형자당구배(linear sucrose gradient)를 사용하는 방법이다. 그러나 자당구배는 크기/직경 및 부력 밀도의 유사성으로 인해 HIV-1 입자에서 엑소좀을 분리하는 데 비효율적인 것으로 나타났다.

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[1] Théry, Clotilde, et al. "Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids." Current protocols in cell biology 30.1 (2006): 3-22.

[2] Jeppesen, Dennis K., et al. "Comparative analysis of discrete exosome fractions obtained by differential centrifugation." Journal of extracellular vesicles 3.1 (2014): 25011.

[3] Witwer, Kenneth W., et al. "Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research." Journal of extracellular vesicles 2.1 (2013): 20360.

[4] Cvjetkovic, Aleksander, Jan Lötvall, and Cecilia Lässer. "The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles." Journal of extracellular vesicles 3.1 (2014): 23111.